尋找能調(diào)控植物的生長發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的功能基因一直是藥用植物研究的重點(diǎn)，但選擇適合的方法驗(yàn)證基因功能驗(yàn)證也是伴隨著困擾廣大研究者的問題。大部分研究利用擬南芥、煙草等模式植物做異源表達(dá)來驗(yàn)證基因功能。但是，許多藥用植物含有自身獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物，而擬蘭芥、煙草等模式植物在進(jìn)化途徑和遺傳背景上與之存在顯著差異，這可能導(dǎo)致研究者對基因的功能不全面甚至錯(cuò)誤的認(rèn)識。因此，每種藥用植物建立一個(gè)自身專屬、穩(wěn)定且有效的基因功能驗(yàn)證體系是十分迫切的。瞬時(shí)表達(dá)體系具有簡單、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，十分適合應(yīng)用于非模式植物的基因功能驗(yàn)證。

近日，成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院、西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室裴瑾教授團(tuán)隊(duì)在國際知名期刊BMC plant biology（中科院分區(qū)2區(qū)）發(fā)表題為The establishment of transient expression systems and their application for gene function analysis of favonoid biosynthesis in Carthamus tinctorius L.的論文，博士研究生鮮彬?yàn)榈谝蛔髡撸徼淌诤完惤苯淌跒橥ㄓ嵶髡?，西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為第一單位。該論文以藥用植物紅花的愈傷組織為材料，分別建立了農(nóng)桿菌和基因槍瞬時(shí)表達(dá)體系，并用于基因功能的驗(yàn)證。

紅花 Carthamus tinctorius L.為菊科紅花屬一年生草本植物，以不帶子房的干燥管狀花入藥。紅花中含有許多黃酮類化合物，其中羥基紅花黃色素A（HSYA）、脫水紅花黃色素B（Anhydrosafflor yellow B）、紅花紅色素（Carthamine）等是紅花獨(dú)有的一類成分，也是影響紅花品質(zhì)的重要化學(xué)指標(biāo)。為解析紅花品質(zhì)形成相關(guān)機(jī)制，許多黃酮合成的相關(guān)基因被篩選克隆，但紅花中缺乏成熟的表達(dá)體系驗(yàn)證基因功能，大多數(shù)候選基因尚未進(jìn)行體內(nèi)功能驗(yàn)證。體內(nèi)基因功能驗(yàn)證常用方法包括穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化，瞬時(shí)表達(dá)體系更加便捷、快速，適合應(yīng)用于非模式植物基因功能研究。農(nóng)桿菌和基因槍是瞬時(shí)表達(dá)體系中常用的介導(dǎo)方法，愈傷組織是瞬時(shí)表達(dá)的常用材料之一。為在紅花中建立黃酮合成相關(guān)基因功能研究的方法體系，該研究首次利用農(nóng)桿菌和基因槍轉(zhuǎn)化法對紅花愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，利用功能已知的基因?qū)λ矔r(shí)表達(dá)體系進(jìn)行了驗(yàn)證。

研究以紅花無菌苗子葉為外植體，誘導(dǎo)出了淡黃、質(zhì)地疏松的愈傷組織。對紅花愈傷組織成分進(jìn)行測定，從愈傷組織中檢測出了多種黃酮類化合物，表明紅花愈傷組織具有作為瞬時(shí)表達(dá)材料的物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 紅花愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果

研究使用載體帶有 GUS 標(biāo)簽。建立農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)體系時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了菌液狀態(tài)、菌液濃度和浸染時(shí)間等條件。轉(zhuǎn)化后的愈傷組織能被染為藍(lán)色，表明農(nóng)桿菌能有效轉(zhuǎn)化紅花愈傷組織，進(jìn)一步通過單因素實(shí)驗(yàn)得出了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化紅花愈傷組織的最佳實(shí)驗(yàn)條件。建立基因槍瞬時(shí)表達(dá)體系時(shí)，實(shí)驗(yàn)考察了氦氣壓力、真空度和轟擊距離等實(shí)驗(yàn)條件；實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轟擊后的愈傷組織用被成功轉(zhuǎn)化，并得到最佳轉(zhuǎn)化條件。

圖2 不同參數(shù)條件下的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率

初步建立兩種瞬時(shí)表達(dá)體系后，實(shí)驗(yàn)通過過表達(dá)紅花中功能已知的基因來驗(yàn)證體系的有效性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因的相對表達(dá)量顯著升高，黃酮類化合物含量也發(fā)生改變，證明了該體系的能夠用于基因功能的驗(yàn)證。

圖3 CtCHS瞬時(shí)表達(dá)結(jié)果

綜上，研究建立了農(nóng)桿菌和基因槍介導(dǎo)的紅花愈傷組織瞬時(shí)表達(dá)體系，并驗(yàn)證了兩種表達(dá)體系的有效性。為后續(xù)驗(yàn)證紅花黃酮合成基因的功能提供了方法基礎(chǔ)，也為其他藥用植物基因功能研究提供思路。

該成果得到國家自然科學(xué)基金：川產(chǎn)道地藥材的道地性研究(No.U19A2010)；四川省“十四五”農(nóng)作物及畜禽育種攻關(guān)項(xiàng)目：突破性道地中藥材育種材料和方法創(chuàng)新及新品種選育——紅花(No.2021YFYZ0012-5)和國家中醫(yī)藥多學(xué)科交叉創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目：西南特色中藥資源多維評價(jià)多學(xué)科交叉創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(No.ZYYCXTD-D-202209)基金項(xiàng)目的支持。

全文鏈接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37032332/

供稿：西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、藥學(xué)院/現(xiàn)代中藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院裴瑾教授課題組。