尋找能調控植物的生長發(fā)育、形態(tài)結構和代謝產物的功能基因一直是藥用植物研究的重點，但選擇適合的方法驗證基因功能驗證也是伴隨著困擾廣大研究者的問題。大部分研究利用擬南芥、煙草等模式植物做異源表達來驗證基因功能。但是，許多藥用植物含有自身獨特的次生代謝產物，而擬蘭芥、煙草等模式植物在進化途徑和遺傳背景上與之存在顯著差異，這可能導致研究者對基因的功能不全面甚至錯誤的認識。因此，每種藥用植物建立一個自身專屬、穩(wěn)定且有效的基因功能驗證體系是十分迫切的。瞬時表達體系具有簡單、快速、準確的優(yōu)點，十分適合應用于非模式植物的基因功能驗證。

近日，成都中醫(yī)藥大學藥學院/現(xiàn)代中藥產業(yè)學院、西南特色中藥資源國家重點實驗室裴瑾教授團隊在國際知名期刊BMC plant biology（中科院分區(qū)2區(qū)）發(fā)表題為The establishment of transient expression systems and their application for gene function analysis of favonoid biosynthesis in Carthamus tinctorius L.的論文，博士研究生鮮彬為第一作者，裴瑾教授和陳江副教授為通訊作者，西南特色中藥資源國家重點實驗室為第一單位。該論文以藥用植物紅花的愈傷組織為材料，分別建立了農桿菌和基因槍瞬時表達體系，并用于基因功能的驗證。

紅花 Carthamus tinctorius L.為菊科紅花屬一年生草本植物，以不帶子房的干燥管狀花入藥。紅花中含有許多黃酮類化合物，其中羥基紅花黃色素A（HSYA）、脫水紅花黃色素B（Anhydrosafflor yellow B）、紅花紅色素（Carthamine）等是紅花獨有的一類成分，也是影響紅花品質的重要化學指標。為解析紅花品質形成相關機制，許多黃酮合成的相關基因被篩選克隆，但紅花中缺乏成熟的表達體系驗證基因功能，大多數(shù)候選基因尚未進行體內功能驗證。體內基因功能驗證常用方法包括穩(wěn)定遺傳轉化和瞬時遺傳轉化，瞬時表達體系更加便捷、快速，適合應用于非模式植物基因功能研究。農桿菌和基因槍是瞬時表達體系中常用的介導方法，愈傷組織是瞬時表達的常用材料之一。為在紅花中建立黃酮合成相關基因功能研究的方法體系，該研究首次利用農桿菌和基因槍轉化法對紅花愈傷組織進行轉化，利用功能已知的基因對瞬時表達體系進行了驗證。

研究以紅花無菌苗子葉為外植體，誘導出了淡黃、質地疏松的愈傷組織。對紅花愈傷組織成分進行測定，從愈傷組織中檢測出了多種黃酮類化合物，表明紅花愈傷組織具有作為瞬時表達材料的物質基礎。

圖1 紅花愈傷組織誘導結果

研究使用載體帶有 GUS 標簽。建立農桿菌瞬時表達體系時，實驗考察了菌液狀態(tài)、菌液濃度和浸染時間等條件。轉化后的愈傷組織能被染為藍色，表明農桿菌能有效轉化紅花愈傷組織，進一步通過單因素實驗得出了農桿菌轉化紅花愈傷組織的最佳實驗條件。建立基因槍瞬時表達體系時，實驗考察了氦氣壓力、真空度和轟擊距離等實驗條件；實驗發(fā)現(xiàn)轟擊后的愈傷組織用被成功轉化，并得到最佳轉化條件。

圖2 不同參數(shù)條件下的瞬時轉化效率

初步建立兩種瞬時表達體系后，實驗通過過表達紅花中功能已知的基因來驗證體系的有效性。結果發(fā)現(xiàn)該基因的相對表達量顯著升高，黃酮類化合物含量也發(fā)生改變，證明了該體系的能夠用于基因功能的驗證。

圖3 CtCHS瞬時表達結果

綜上，研究建立了農桿菌和基因槍介導的紅花愈傷組織瞬時表達體系，并驗證了兩種表達體系的有效性。為后續(xù)驗證紅花黃酮合成基因的功能提供了方法基礎，也為其他藥用植物基因功能研究提供思路。

該成果得到國家自然科學基金：川產道地藥材的道地性研究(No.U19A2010)；四川省“十四五”農作物及畜禽育種攻關項目：突破性道地中藥材育種材料和方法創(chuàng)新及新品種選育——紅花(No.2021YFYZ0012-5)和國家中醫(yī)藥多學科交叉創(chuàng)新團隊項目：西南特色中藥資源多維評價多學科交叉創(chuàng)新團隊(No.ZYYCXTD-D-202209)基金項目的支持。

全文鏈接： https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37032332/

供稿：西南特色中藥資源國家重點實驗室、藥學院/現(xiàn)代中藥產業(yè)學院裴瑾教授課題組。