近期，成都中醫(yī)藥大學(xué)西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院黎勝紅研究團(tuán)隊(duì)在國(guó)際化學(xué)頂級(jí)期刊Angewandte Chemie - International Edition（Nature Index，中科院JCR一區(qū)）上發(fā)表了題為 “A cryptic plant terpene cyclase producing unconventional 18- and 14-membered macrocyclic C25 and C20 terpenoids with immunosuppressive activity”的研究論文。
萜類化合物是植物中種類最多、化學(xué)結(jié)構(gòu)變化最為豐富的一類天然產(chǎn)物，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮著重要作用，并具有重要藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。二倍半萜是一類稀有的萜類天然產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)新穎復(fù)雜、生物活性廣泛，大多存在于海洋生物中，目前對(duì)于二倍半萜在植物中的分布規(guī)律、生物功能與生物合成知之甚少。黎勝紅研究團(tuán)隊(duì)多年來(lái)致力于特色藥用植物中萜類天然產(chǎn)物的化學(xué)多樣性、生物功能和生物合成研究。近期該團(tuán)隊(duì)從唇形科藥用植物米團(tuán)花中鑒定了一個(gè)雙功能的二倍半萜/二萜合酶，能夠催化生成6個(gè)大環(huán)二倍半萜和2個(gè)大環(huán)二萜產(chǎn)物，其中5個(gè)為新化合物，包括2個(gè)首次發(fā)現(xiàn)的具有18元環(huán)的二倍半萜，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的具有最大碳環(huán)結(jié)構(gòu)的萜類天然產(chǎn)物。通過(guò)分子對(duì)接結(jié)合定點(diǎn)突變獲得了2個(gè)二倍半萜產(chǎn)量顯著提高的突變酶，并發(fā)現(xiàn)大環(huán)二倍半萜的免疫抑制活性。
該團(tuán)隊(duì)從米團(tuán)花腺毛轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)預(yù)測(cè)定位于葉綠體的TPS-a家族萜類合酶LcTPS2，運(yùn)用工程大腸桿菌和本氏煙草異源表達(dá)體系，發(fā)現(xiàn)LcTPS2催化GFDP和GGDP分別形成6個(gè)二倍半萜和2個(gè)二萜產(chǎn)物。通過(guò)分離純化、現(xiàn)代波譜技術(shù)結(jié)合DP4+計(jì)算，鑒定化合物1和2為具有18元碳環(huán)的二倍半萜，化合物3-6為14元碳環(huán)的二倍半萜，化合物7和8為14-元碳環(huán)的西松烷二萜。二萜化合物7和8在米團(tuán)花的葉中可被檢測(cè)到，而二倍半萜化合物1-6在該植物中均未檢測(cè)到，推測(cè)可能被轉(zhuǎn)化成進(jìn)一步官能團(tuán)化的產(chǎn)物。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，LcTPS2主要在米團(tuán)花葉中表達(dá)，茉莉酸甲酯可誘導(dǎo)LcTPS2的表達(dá)量增高，且與LcGFDPS和LcGGDPS 3/4（二倍半萜和二萜直鏈前體生物合成的關(guān)鍵酶）的表達(dá)呈正相關(guān)，同時(shí)二萜化合物的含量也升高。體外酶促反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，LcTPS2同時(shí)具備萜類合酶和異戊烯基轉(zhuǎn)移酶的功能，能夠催化合成大環(huán)萜類和異戊烯基吲哚類化合物。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，LcTPS2可能起源于倍半萜合酶的復(fù)制和新功能化，但其倍半萜合酶活性完全喪失，此外，LcTPS2區(qū)別于十字花科植物中的二倍半萜合酶，具有獨(dú)立的起源和進(jìn)化。
通過(guò)分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)了17個(gè)可能與底物相互作用（直接或間接）或位于柔性位點(diǎn)/活性腔底部的氨基酸殘基。結(jié)合定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建了28個(gè)突變酶，發(fā)現(xiàn)上述17個(gè)氨基酸殘基對(duì)酶的催化效率和/或產(chǎn)物特異性至關(guān)重要。其中，2個(gè)突變酶F516A和F516G的二倍半萜化合物產(chǎn)量顯著提高（分別為野生型的3.3倍和2.5倍），同時(shí)二萜化合物產(chǎn)量減少；而L298位點(diǎn)突變后，二倍半萜產(chǎn)量嚴(yán)重減少，二萜產(chǎn)量則影響較小，推測(cè)減小F516殘基大?。ㄍ蛔?yōu)锳/G）可能導(dǎo)致活性腔變大，從而偏好C25底物，而增加L298殘基大?。ㄍ蛔?yōu)閃/Y/F）則活性腔變小，從而偏好C20底物。
活性篩選發(fā)現(xiàn)，二倍半萜化合物1、3、5和6對(duì)PHA聯(lián)合PMA誘導(dǎo)的Jurkat細(xì)胞分泌IL-2有明顯抑制作用，化合物1和3對(duì)CD3/CD28單抗誘導(dǎo)小鼠T細(xì)胞分泌IFN-γ也有明顯抑制作用。與此同時(shí)，在濃度為40 μM時(shí)，所有化合物對(duì)小鼠脾細(xì)胞均無(wú)明顯細(xì)胞毒性。Western blot分析表明，化合物1和3可能通過(guò)抑制ERK和JNK的磷酸化影響MAPK信號(hào)通路，從而發(fā)揮免疫抑制活性。該研究為大環(huán)二倍半萜類活性天然產(chǎn)物生物合成工具酶的開發(fā)應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)，并為揭示植物二倍半萜的化學(xué)多樣性、分布規(guī)律、生物功能和生物合成等提供了有價(jià)值的參考。
博士研究生陳月桂、李德森和凌伊碩士為本文共同第一作者，黎勝紅教授和劉燕教授為本文通訊作者。該工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（21937006）、國(guó)家杰出青年基金項(xiàng)目（31525005）和云南省生物醫(yī)藥重大科技專項(xiàng)（2019ZF011-2）等資助。
文章鏈接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202110842
（文、圖/中醫(yī)藥創(chuàng)新研究院 李丹 編輯/霍文?。?/span>